准确检测食品过敏原对加强食品安全管理至关重要。有效合理的预处理方法可以减少杂质的干扰，提高过敏原的提取效率，从而对检测的灵敏度和准确性起到重要作用。
2024年4月，南昌大学陈红兵教授团队在Food Chemistry（IF=8.4）上发表题目为Lipid matrix-specific pretreatment method for enhancing the extractability and allergenicity maintenance of bovine milk allergens in ELISA detection的研究成果。该研究开发了一种针对脂质基质的预处理的方法。然后利用蛋白质组学分析确认了预处理对过敏原提取效果的影响。该研究为食品过敏原检测提供了新策略，强调了匹配食品基质和过敏原类型的预处理方法的重要性。
马竞直播为该研究提供蛋白质谱检测和分析服务。
根据成分特性，将食品基质进行分类，特别是针对脂质基质。
结合超声辅助正己烷脱脂和弱碱性提取系统，为牛乳过敏原开发特定的预处理方法。
使用免疫学定量和光谱分析来评估过敏原的提取效率。
通过LC-MS/MS分析、KU812细胞脱颗粒模型和西方印迹法来确认过敏原性是否得到保持。
对准确性（Bias）、重复性（RSDr）、稳定性（RSDR）进行评估。
将预处理方法应用于20种商业食品，并与商业ELISA试剂盒比较。
使用LCSM（激光共聚焦扫描显微镜）和SEM（扫描电子显微镜）观察预处理后脂肪和蛋白质的微观结构变化。
测量提取物的粒径和zeta电位，评估分散系统的稳定性。
通过对比12种缓冲液，研究发现弱碱性缓冲液（如PBS 8.2）更有效地提取牛乳过敏原，且对蛋白质结构破坏较小。SDS-PAGE分析表明醋酸和柠檬酸缓冲液处理的样品电泳带型有显著差异，不利于蛋白质提取和结构维持。CD（圆二色光谱）和内源荧光光谱分析显示弱碱性缓冲液有助于保持蛋白质的二级和三级结构。ELISA测定发现PBS 8.2和TBS 8.2在提取主要牛乳过敏原ALA、BLG和CSN方面最有效。据此，建立了三种优化的过敏原预处理方法（ALA-Pre、BLG-Pre和CSN-Pre），显著提升了提取效率和检测准确性（图1）。
图1 用BLG-Pre和商品试剂盒前处理方法分析不同商品食品中BLG的回收率
在蛋白质组学分析中，不同预处理方法对牛乳过敏原提取物的蛋白质组成和相对含量有显著影响。ALA-Pre、BLG-Pre和CSN-Pre三种方法分别鉴定出500、470和481种蛋白质，其中451种为共同鉴定，而每种方法独特鉴定的蛋白质分别为7、1和4种。层次聚类分析发现138种显著差异蛋白，热图显示BLG-Pre形成独立聚类，ALA-Pre和CSN-Pre形成亚簇，与PCA分析一致。
深入分析七种常见过敏原，包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等，气泡图和补充表S3显示三种预处理方法对特定过敏原提取具有特异性。ALA-Pre、BLG-Pre和CSN-Pre组中丰度最高的过敏原分别为κ-酪蛋白、κ-酪蛋白和αs2-酪蛋白，反映了酪蛋白的高含量和提取效率。特别是αs2-酪蛋白，在CSN-Pre组中的丰度显著高于其他组。
图2 过敏原提取物的蛋白质组学分析。（A）蛋白质数量，（B）PCA分析，（C）差异蛋白质聚类分析，（D）常见牛奶过敏原的相对丰度
通过KU812细胞脱颗粒模型评估了不同预处理方法对牛乳过敏原过敏原性的影响。实验结果显示，与对照组相比，所有预处理提取物均能显著诱导细胞释放β-己糖苷酶、组胺、IL-4和IL-6，表明过敏原性未受损害。此外，Western blotting分析证实了预处理后的过敏原保持了与对照组相似的IgG结合能力，没有显著变化（图3）。这些结果表明，所建立的预处理方法有效保持了牛乳过敏原的免疫反应性和过敏原性。
分析ELISA数据后，显示预处理方法具有出色的准确性（偏差均值分别为-8.47%、-7.94%和-8.90%）。ALA-Pre的重复性和稳定性（RSDr为1.52%，RSDR为5.65%），BLG-Pre（RSDr为0.77%，RSDR为3.84%），以及CSN-Pre（RSDr为2.54%，RSDR为6.81%）均在可接受范围内，证明了这些预处理方法在提取牛乳过敏原时的准确性、重复性和稳定性。
图3 使用相应的兔血清对过敏原进行蛋白质印迹分析。(A) ALA，(B) BLG，(C) CSN
在实际食品中的应用测试显示，与商业试剂盒相比，新开发的预处理方法在提取高脂食品中的牛乳过敏原方面更有效，特别是在提取ALA和BLG时，含量显著高于商业试剂盒。此外，通过LCSM和SEM成像，新方法在脱脂和过敏原释放方面表现更优，诱导形成了更松散的微结构（图4）。粒子尺寸和Zeta电位的测量结果进一步证实了新预处理方法在形成稳定分散系统方面的优势，从而提高了过敏原的提取效率和稳定性（图5）。
图4 LCSM(A)观察脂质分布，扫描电子显微镜(B)观察超微结构。放大倍数为10k
图5 过敏原提取物的粒径(A)和zeta电位(B)
本研究创新性地根据食品基质的组成特性分类，并为脂质基质中的牛乳过敏原检测开发了匹配的预处理方法。研究结果为食品过敏风险管理提供了科学依据，并指出了根据食品基质和过敏原类型匹配相应预处理方法的必要性。
