马铃薯是全球第四大粮食作物，其块茎贮藏蛋白必需氨基酸（EAA）含量高、功能特性好，被广泛认为是最有价值的植物蛋白之一。然而，与小麦面筋蛋白相比，马铃薯块茎贮藏蛋白含量较低且缺乏可形成分子间二硫键的半胱氨酸对，导致马铃薯粉团的粘度差，阻碍了其在食品加工领域中的应用。
2024年1月23日，中国农业科学院农业基因研究所黄三文院士团队、中国农科院蔬菜花卉研究所徐建飞研究员团队和云南师范大学尚轶教授团队在Food Chemistry ( IF 8.8 )在线发表了“Deep learning-based characterization and redesign of major potato tuber storage protein” 研究成果。该研究使用基于人工智能（Artificial Intelligence, AI）蛋白设计策略，在马铃薯主要贮藏蛋白Patatin表面引入多个半胱氨酸位点，促进了由二硫键连接的聚合物形成，并显著提高马铃薯面团的粘性和营养成分。马竞直播非常荣幸参与了该研究中二硫键检测相关工作。
文章标题：Deep learning-based characterization and redesign of major potato tuber storage protein
发表期刊：Food Chemistry
影响因子：8.8
发表时间：2024年1月23日
马铃薯贮藏蛋白含量、淀粉量测定以及结构特征分析；
AlphaFold2分析贮藏蛋白Patatin17的二聚体结构；
酵母双杂交和分裂荧光素酶检测Patatin17二聚体形成；
蛋白质设计工具在Patatin17二聚体结构表面引入六个半胱氨酸；
利用质谱技术对Patatin17二聚体进行二硫键确证；
评估Patatin17-V6多聚物在马铃薯粉面团上的加工效果。
为了研究马铃薯贮藏蛋白的特性，研究人员测定了21份四倍体和195份二倍体品系的马铃薯块茎蛋白含量，发现二倍体马铃薯蛋白含量差异较四倍体马铃薯更为显著（图1A）。又测量了28份二倍体品系马铃薯的块茎淀粉含量，发现这些二倍体的块茎蛋白与淀粉含量之间存在预期的相关性(图1B)。这一发现揭示了块茎干物质生物合成过程中，资源分配和内部竞争受到严格的调控。采用扫描电子显微镜（SEM）观察发现与小麦蛋白相比，马铃薯块茎蛋白不能有效地粘附淀粉颗粒（图1C-D）。
图1：块茎贮藏蛋白的主要特性及结构分析
Patatins，一种主要的块茎贮藏蛋白，位于液泡中的非特异性脂肪酶。尽管Patatin17（Pat17）有一种晶体结构，但尚未确定Pat17是否在块茎中作为二聚体发挥作用。研究人员进一步基于深度学习的蛋白结构预测方法构建了Pat17的二聚体模型，采用酵母双杂交和分裂荧光素酶检测法预测Pat17的相互作用。在Pat17二聚体模型中，发现Patatin17通过氢键网络形成同源二聚体（图1F-G），并通过点突变实验进一步验证了该发现。
蛋白质之间二硫键的形成对面团粘度至关重要，研究人员应用蛋白质设计工具在Pat17序列中加入了六个半胱氨酸，四个半胱氨酸（C88、C148、C178和C382）位于Pat17的表面，另外两个半胱氨酸（C220和C294）则在蛋白互作的内部（图2A-B）。为了检测该蛋白变体之间是否能形成二硫键，研究人员在大肠杆菌中表达了Pat17-V6，并纯化后进行SDS-PAGE和免疫印记检测。结果发现在非还原条件下，Pat17可形成二聚体和多聚体。使用还原剂处理后，多聚体形式的Pat17可恢复为单体形式（图2C-D）。
图2：Patatin17二硫键的设计
接下来，从非还原条件下纯化的Pat17-V6二聚体进行二硫键检测。基于质谱分析，共鉴定出两个二硫键C178-C178和C178-C382，它们交联了Pat17-V6二聚体（图3A-B）。其中，突变实验发现A178C位点的单点突变使Patatin17在非还原条件下形成了二聚体，与质谱鉴定结果一致（图3C-D）。值得注意的是，虽然C220和C294在蛋白质相互作用界面内很接近（图2B），但在该界面上并没有形成二硫键，表明多个氢键的存在可能是影响二硫键形成的因素之一。
图3：Patatin17多聚体中二硫键的确证
最后，研究人员评估了Pat17-V6多聚物在马铃薯粉面团上的加工效果。通过将马铃薯粉团与等量的Pat17或Pat17-V6混合。虽然添加 Pat17可提高样品粘度，但添加 Pat17-V6对粘度的提升显著高于添加Pat17（图4A-B）。使用扫描电镜评估不同处理条件下马铃薯面团微观结构的变化，发现以缓冲液（阴性对照）制备的马铃薯面团表面粗糙，淀粉颗粒不能粘附在一起；当马铃薯面团与Pat17混合时，颗粒表面比对照更光滑；当用Pat17-V6制备样品时，观察到最光滑和最紧密的颗粒（图4C-E）。综上结果表明，通过二硫键连接的Pat17-V6聚合物可以充当分子“胶水”，显著改善马铃薯面团的加工特性和营养品质（图4F）。
图4：Pat17-V6对马铃薯面团粘度和形态的作用
研究人员利用AI蛋白质设计技术，通过在马铃薯Pat17表面添加6个半胱氨酸，从而增加二硫键来提高其粘性和营养成分。该研究表明基于深度学习的蛋白质设计策略不仅能够有效地表征蛋白质，而且能够为未来的食物来源创造新的蛋白质。
