单细胞蛋白质组学是人们研究的热点，目前已可以实现单个细胞4000-5000种蛋白质检测（>>>点击直达：4000+ | 单细胞蛋白质组，你也需要升级迭代！）。随着技术的快速发展，超微量的前处理技术和超高灵敏度的质谱技术推动了研究者们从单细胞中挖掘更多的信息。
2024年7月19日，美国明尼苏达州梅奥诊所实验室的研究者们在Communications biology上发表论文[1]，探讨了蛋白翻译后修饰、突变肽等的单细胞异质性问题。
梅奥诊所的研究团队在前期实验中通过优化捕获离子迁移谱 (TIMS) 的设置，证明了在无标记模式下以单细胞分辨率检测磷酸化和乙酰化的可行性[2]。该研究团队使用timsTOF SCP质谱仪对人类正常胆管细胞系和胆管癌细胞系进行了单细胞蛋白质组和 PTM 分析，包括磷酸化、甲基化和乙酰化，除此之外还首次进行了癌细胞常见突变蛋白的突变肽分析，以及单细胞核蛋白质组学的尝试。
图1. 单细胞蛋白质组学工作流程
根据工作流程（图1），作者采用了数据非依赖采集 (DIA) 并行积累-连续碎片 （diaPASEF） 模式进行质谱检测。相比大细胞量蛋白质组学DDA数据建库的结果，作者发现2~5ng蛋白量（大约20~50个细胞）DDA检测建库能实现最大蛋白质组覆盖率，且与不建库模式相比，建库后基于库的蛋白鉴定数量明显更多（图2）。
图2. diaPASEF建库蛋白输入量探索（使用DIA-NN搜库）
作者对正常人胆管细胞系 (NHC) 和三种胆管癌细胞系 (HuCCT-1、RBE 和 EGI-1) 进行了单细胞蛋白质组分析。从 200 个单细胞中共鉴定出 4197 种蛋白质（41,560种肽），平均每个细胞 2548 种蛋白质（图3）。降维聚类结果显示正常细胞（NHC）和癌细胞分离，三种癌细胞有一定程度分离。差异表达分析显示，与正常细胞相比，癌细胞中 84 种蛋白质上调，131 种蛋白质下调。蛋白质的亚细胞定位显示，大多数已鉴定的蛋白质（56%）属于细胞质，其次是细胞核（27%）和质膜（8%），鉴定的蛋白质中，酶占大多数（961 种蛋白质），还伴有 262 种转运蛋白、227 种转录调节因子、145 种激酶和 64 种磷酸酶。
图3.单细胞蛋白组基本分析（PCA降维聚类、差异分析、蛋白亚细胞定位、蛋白功能注释）
除了单细胞蛋白表达分析，作者还对数据进行蛋白翻译后修饰分析。共鉴定出 192 种磷酸化肽（116 种蛋白质的 182 个位点）、24 种赖氨酸甲基化肽（19 种蛋白质的 24 个位点）、20 种赖氨酸二甲基化肽（13 种蛋白质的 17 个位点）、14 种赖氨酸三甲基化肽（10 种蛋白质的 11 个位点）、17 种赖氨酸乙酰化肽（13 种蛋白质的 14 个位点）和 16 种赖氨酸甲酰化肽（12 种蛋白质的 16 个位点）（图4）。不富集直接搜库的结果显示本方法可以检测到蛋白的多个修饰位点，例如鉴定出核仁素的四个磷酸化位点（Ser 67、Thr 76、Thr 121 和 Ser 563），这些鉴定结果通过合成肽的洗脱时间和碎片离子得到证实（图4a）。还检测到了组蛋白和延伸因子 1-alpha 1 等蛋白的多种 PTM，例如在组蛋白 3.1 的赖氨酸（K14、K23、K27 和 K79）上检测到了甲基化、二甲基化、三甲基化、乙酰化和甲酰化等五种类型的 PTM（图4b）。组蛋白 H3 修饰会影响基因表达，例如 H3K14 乙酰化与基因表达激活相关，已知后者与 H3K23 乙酰化共存并偶联；H3K79 甲基化与活性基因的转录区相关；而 H3K27 甲基化通过接近或环化沉默基因表达相关，并且 H3K79 甲酰化被认为可能沉默基因表达。因此，作者利用单细胞水平的组蛋白 H3 修饰数据，计算了激活基因表达与抑制基因表达的 PTM 比率以观察细胞整体的转录活性（图4c）。从结果能观察到较高的比率可能表明大多数细胞的转录活性较高，这证实了所研究的细胞是增殖性肿瘤细胞系。以上的结果显示：以单细胞水平的组蛋白修饰作为介质，有可能在单细胞分辨率下揭示由基因调控和转录活性驱动的单个细胞状态。
图4. 单细胞数据中鉴定出的蛋白质、磷酸化、N 端乙酰化、赖氨酸单甲基化、二甲基化、三甲基化、乙酰化和甲酰化肽的数量
作者通过整合上述三种癌细胞系体细胞单核苷酸变异 (SNP) 数据库 (depmap.org)，检验了在单细胞水平上检测具有单一氨基酸多态性 (SAP) 肽的可行性。通过分析合成肽混合物并评估洗脱时间和碎裂模式的相似性来鉴别这些肽（图1）。作者在单细胞水平上成功地鉴定了含有与 G12D 相对应的 KRAS 变异的肽以及其他三种变异——IQGAP1 G1047R、CCT8 A488T 和 GMPS R435T（图5a）。重要的是，具有 KRAS G12D 变异的肽 LVVVGADGVGK 仅在 HuCCT-1 和 EGI-1 细胞中检测到，而未在 RBE 细胞中检测到，这与 DepMap 中注释的基因组测序结果一致。同样，源自 CCT8 A4888T 变异的肽 NVGLDIEAEVPTVK 仅在 RBE 细胞中检测到，这再次与 DepMap 中的数据一致。随着单细胞蛋白质组覆盖深度的不断发展，更多来自其他类型变异（如插入/缺失和融合基因）的肽可能会被检测到。
图5. 以单细胞分辨率识别 SAP
单细胞转录组学发展出了单细胞核转录组学，单细胞蛋白质组学能不能也发展出单细胞核蛋白质组呢？作者尝试按照snRNA-seq的方法制备了用他泽司他处理的浆液性卵巢癌细胞系 PEO1的单细胞核悬液，他泽司他是一种临床批准的组蛋白甲基转移酶 EZH2 的表观遗传抑制剂，可甲基化组蛋白 3.1 的赖氨酸 27（图6a）。按照上述的方案，生成了30个单核样本的 diaPASEF 数据，处理组和对照组分别有15个细胞核，共计得到 6221 个肽，对应 1008 种蛋白质，平均每个样本 627 种蛋白质（图6c）。重点是作者在 K14、K23、K27 和 K79 鉴定出组蛋白 H3.1 的六种不同 PTM，其中大多数在每个单核样本中都能检测到（图6d）。他泽司他治疗后，H3K27 的三甲基化水平降低，而组蛋白 H3.1 的总蛋白质丰度没有显著变化（图6e）。上述结果证明：单核蛋白质组学不仅可行还可以通过检测组蛋白修饰来研究可能影响基因表达的药物的具体机制。
图6. 单核蛋白质组和 PTM 分析
本研究进行了单细胞/单细胞核蛋白质组学、单细胞/单细胞核蛋白翻译后修饰组学以及单细胞SAP分析研究，证明了单个细胞甚至单个细胞核的超低微量蛋白质能够应用于蛋白质组学和蛋白翻译后修饰研究，使得单细胞蛋白质组学的研究向前又迈了一步。
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参考文献
[1] Mun, DG., Bhat, F.A., Joshi, N. et al. Diversity of post-translational modifications and cell signaling revealed by single cell and single organelle mass spectrometry. Commun Biol 7, 884 (2024).
[2]Mun, D. G. et al. Optimizing single cell proteomics using trapped ion mobility spectrometry for label-free experiments. Analyst 148, 3466–3475 (2023).
