细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为液体活检的新星，引起了人们的兴趣，用以补充癌症筛查的不准确性和组织活检的侵入性。前列腺癌(PCa)是男性最常见的癌症之一，而传统的前列腺特异性抗原（PSA）检测存在准确性和侵入性问题。为了克服这些限制，科学家们一直在寻找新的生物标志物。
近日，宁波大学附属第一医院泌尿外科蒋军辉教授团队&澳大利亚新南威尔士大学李勇教授团队，在《Advanced Science》上发表了一项题目为 “Proteomic Identification of Small Extracellular Vesicle Proteins LAMB1 and Histone H4 for Prostate Cancer Diagnosis and Risk Stratification”的突破性研究，通过无标记质谱技术对来自不同前列腺癌细胞系的小细胞外囊泡（sEVs）样本进行蛋白质组学分析，以鉴定潜在的sEVs蛋白生物标志物，并通过PRM靶向蛋白质组学、WB和ELISA对来自不同前列腺癌阶段的人血浆和尿液样本进行验证。该研究揭示了sEVs蛋白LAMB1和Histone H4作为PCa诊断和风险分层的潜在生物标志物。
图1：研究设计示意图
利用非标记定量蛋白质组学技术，对PCa细胞系（PC3、DU145、LNCaP和22Rv1）和正常前列腺上皮细胞系（RWPE-1）的sEVs，进行了深入研究，共鉴定到1570种蛋白，其中878种蛋白被定量，表现出在不同前列腺癌细胞系和正常前列腺上皮细胞中的表达差异。GO富集分析显示，所有sEV样本中，“细胞外外泌体”和“细胞外囊泡”成分丰富，这强调了sEVs及其在PCa中的重要作用。在所有五种细胞系sEVs中，发现了219种共有蛋白，133种sEV蛋白质仅在PCa细胞系中表达，5种sEV蛋白质仅在转移性PCa细胞系中表达。在超过50%的PCa样本中筛选出20种潜在sEV蛋白（在转移性PCa细胞系sEVs中高表达，而在局部原发性PCa细胞系或正常前列腺上皮细胞系sEVs中表达缺失或极低）进行进一步验证。
图2：PCa细胞系sEV蛋白的分析
为了验证PCa细胞系中潜在的sEV生物标志物，并评估其作为PCa患者诊断或风险分层标志物的潜力，对来自不同疾病风险和分期的临床样本（健康对照组n=12，低风险PCa患者n=12，高风险PCa患者n=12，转移性mPCa患者n=12）进行了PRM靶向质谱分析。研究发现，血浆中的sEV LAMB1表达在高风险组和转移性PCa组之间存在显著差异，而尿液样本中的sEV Histone H4表达在高风险组与低风险组、对照组和转移性组之间也存在显著差异。提示LAMB1和Histone H4可能是候选生物标志物。此外，sEV中包含大量非PCa细胞特异性蛋白质，这可能与生物样本的来源有关。
通过WB进一步验证了sEV蛋白LAMB1和Histone H4在PCa细胞系中的表达与蛋白质组学结果一致，但正常RWPE-1细胞与PCa细胞系中sEV蛋白表达存在显著差异，这可能与不同细胞类型通过自分泌或主动分泌sEVs来调控邻近或远距离细胞的机制不同有关。此外，对人血浆和尿液样本的WB分析进一步证实了这些发现，但仅部分验证了LCMS/MS结果。但sEV蛋白在血浆和尿液中的表达水平不同，表明临床样本中sEV蛋白表达具有变异性。这些发现与PRM结果一致，为sEV蛋白LAMB1和Histone H4作为诊断标志物的进一步研究提供了依据。
图3：用PRM和WB验证PCa样品中选定的sEV蛋白
sEV蛋白在PCa诊断和分层中的潜在临床应用。通过ELISA方法，在血浆和尿液样本中分析了sEV蛋白LAMB1和Histone H4的表达水平，并与现有的血清PSA检测进行了比较。结果显示，LAMB1在mPCa患者中的表达显著升高，其诊断准确性高于血清PSA。同时，Histone H4能够区分低风险和高风险PCa患者，其诊断价值也高于血清PSA。此外，将LAMB1和Histone H4与血清PSA结合使用，可进一步提高诊断价值。这些结果提示，sEV蛋白LAMB1和Histone H4在PCa诊断和分层中具有潜在的临床价值，并可能成为改进现有诊断方法的候选生物标志物。
图4：PCa患者血浆和尿液中sEV蛋白LAMB1和Histone H4的临床验证
通过免疫组织化学（IHC）染色法分析了人组织样本，以进一步探讨sEV蛋白在PCa中的临床相关性。研究发现，与正常前列腺组织相比，PCa组织中LAMB1和Histone H4蛋白的表达均增加。进一步分析显示，sEV LAMB1在血液中和Histone H4在尿液中的表达可能与PCa细胞分泌有关。此外，对手术期间获取的PCa组织样本进行分析发现，LAMB1蛋白在转移组中的表达模式与其他组别存在显著差异，且与血浆中sEV LAMB1的表达一致。然而，Histone H4在尿液sEV中的表达模式与PCa组织中的表达不一致，可能受其他因素影响。最后，通过cBioPortal数据集的分析，发现高表达的LAMB1和Histone H4与PCa患者的不良预后和低生存率相关，提示这两种sEV蛋白在PCa的诊断、预后和治疗中具有潜在价值。
图5：LAMB1和Histone H4在临床PCa组织中的临床关联
该研究通过外泌体（sEVs）蛋白质组学分析，发现了两种具有高特异性和敏感性的蛋白标志物：LAMB1和组蛋白H4，为前列腺癌的诊断和风险分层提供了新的生物标志物。
参考文献
[1] Pang B, Wang Q, Chen H, et al. Proteomic Identification of Small Extracellular Vesicle Proteins LAMB1 and Histone H4 for Prostate Cancer Diagnosis and Risk Stratification[J]. Advanced Science 2024 Apr 8: e2402509.
