三阴性乳腺癌（TNBC）是复发率和死亡率最高的乳腺癌亚型，化疗一直是其一线治疗方法，但在转移性TNBC中传统化疗药物效果有限。进入外周血的循环肿瘤细胞（CTC）具有免疫逃逸并定植发展为转移灶的潜力，尤其是具有干性的多个CTC集群（CTC簇）。一些介导细胞粘附和干性的糖蛋白能驱动CTC簇的形成，然而糖基化在CTC簇形成中的作用尚未完全阐明。
2023年9月，美国西北大学范伯格医学院的研究团队对敲除特定基因的乳腺癌细胞糖蛋白唾液酸化水平进行了糖基化蛋白质组学检测，发现并验证了ST6GAL1下调能引起CTC簇糖蛋白末端唾液酸化丧失，导致细胞以休眠的方式逃避化疗发生转移定植。糖基化蛋白质组学筛选发现ST6GAL1的底物糖蛋白PODXL是对抗CTC簇化疗逃逸与转移的候选靶点。
【文章标题】Dynamic Glycoprotein Hyposialylation Promotes Chemotherapy Evasion and Metastatic Seeding of Quiescent Circulating Tumor Cell Clusters in Breast Cancer
【发表期刊】Cancer Discovery
【影响因子】29.497
【发表时间】2023年9月
【发表单位】美国西北大学范伯格医学院
对162名III-IV期乳腺癌患者进行血样采集，并在3个月后的放疗评估时对其中一半患者再次采血。约半数二次采血的患者在两次采血间隔接受化疗。计数分析发现，CTC数量多与患者不良预后相关，化疗患者CTC簇数量显著增加，且CTC簇数量增加或稳定高计数的患者预后更差（图1C）。
图1 化疗与CTC簇的形成和α2,6-SA、ST6GAL1的丢失相关
流式细胞术分析发现CTC簇中α2,6-唾液酸（α2,6-SA）水平显著低于单个CTC；化疗或紫杉醇（PAX）治疗后CTC簇中α2,6-SA水平特异性降低（图1E）。使用人源性组织异种移植（PDX）模型发现PAX治疗导致荷瘤小鼠肺转移增加（图I,J）、CTC簇比例增加（图1L）和α2,6-SA水平，即接骨木凝集素（SNA）信号降低（图1M,N）。
悬浮细胞成团实验显示低α2,6-SA化促进肿瘤细胞成簇（图2A）。敲除介导细胞粘附的CD44后，细胞α-2,6-SA水平和ST6GAL1表达增加，ST6GAL1抑制肿瘤细胞成簇能力（图2B）。
检测人ST6GAL1 KO（ST6KO）肿瘤细胞（MDA-MB-231和PDX）和小鼠ST6KO肿瘤细胞（4T1）的糖基化蛋白质组，发现ST6KO MDA-MB-231细胞中糖蛋白α2,6-SA化完全消失，流式细胞术等方法平行检测验证了该结果（图2B）。
PAX以剂量依赖的方式降低PDX CTC-092和MDA-MB-231细胞的α2,6-SA（图2D），并在25 μg/mL的低剂量下促进耐药CTC-092细胞成簇（图2E）。α2,6-SA低的细胞对PAX更为耐受（图2F），表明α2,6-SA缺乏与细胞PAX抗性和/或逃逸有关，且对比其他化疗药物发现这种耐药具有特异性。
图2 α2,6-SA和ST6GAL1抑制细胞成簇并赋予细胞PAX敏感性
Ki-67染色显示与单一CTC相比，CTC簇增殖能力减弱（图3A,F,G），化疗后G1-G0期的细胞增加更多（图3D），且DNA含量与α2,6-SA含量正相关（图3E,F）。RNA测序后的富集分析发现ST6KO细胞中细胞周期被抑制，干扰素反应、细胞粘附、上皮-间质转化和炎症反应上调（图3H-J）。分析细胞生长和细胞周期，发现ST6KO细胞的融合性生长速度延迟（图3K），静止期（G0）细胞比例增加（图3M,N），形成的克隆更小。在竞争增殖试验中，ST6WT细胞占优势，但低剂量PAX处理下ST6KO细胞占优势。低α2,6-SA CTC的乳腺癌患者无远端转移生存期较差，ST6GAL1 mRNA、蛋白高表达患者预后均较良好。这些结果表明缺乏ST6GAL1的肿瘤细胞在G0期静止，具有化疗逃逸优势，能导致患者不良预后。
图3 缺乏α2,6-SA和ST6GAL1与CTC簇的静止有关
免疫组织化学染色和流式细胞术发现单个CTC中ST6GAL1水平高于CTC簇，α2,6-SA水平低于原发肿瘤细胞和肺转移灶，RNA测序印证了该结果。小鼠尾静脉注射发现低α2,6-SA组细胞肺转移后均变为了高α2,6-SA播散性肿瘤细胞（DTC）。
基于多个TNBC PDX肿瘤的聚糖谱鉴定出α2,6-SA高的M1和M3 PDX和α2,6-SA低的M2 PDX（图4A）。与M1 PDX相比，M2肿瘤细胞生长速度较慢，但形成的簇大5倍（图4B），自发肺转移信号强度高108倍（图4D）。在上述细胞中扰动ST6GAL1，发现α2,6-SA水平升高抑制细胞成簇（图4F）。尾静脉注射发现ST6KO细胞播散与肺转移增加（图4I），原位移植瘤发现ST6KO组的肿瘤起始时间延迟、生长较慢，ST6KO M2肿瘤细胞自发肺转移更多（图4L-N），且CTC，尤其是CTC簇更多。
尾静脉注射、原位移植瘤发现低水平的ST6GAL1导致血液CTC簇增加、肺转移增加和增殖能力降低（图4N）。跨内皮迁移试验发现ST6KO MDA-MB-231肿瘤细胞迁移效率更高。以上结果表明ST6GAL1具有双边调节作用，即缺乏ST6GAL1减缓肿瘤生长，但促进CTC聚集与肺转移；ST6GAL1上调促进肿瘤生长，但抑制肿瘤播散转移。ST6GAL1在CTC中的短暂缺失使CTC的聚集与定植增加，而DTC中ST6GAL1的恢复使定植后肿瘤生长增加。
图4 在PDX模型中，ST6GAL1抑制簇的形成并阻断转移的发生
使用接骨木凝集素（SNA）结合MDA-MB-231 ST6WT和ST6KO细胞膜组分或全细胞裂解物中的α2,6-SA化蛋白并进行糖基化蛋白质组学分析（图5A），共鉴定出217种互作蛋白，其中68个特征性N-糖肽属于14种糖蛋白（图5B），IP-WB实验证明其中PODXL、CD97、ECE1、ALCAM1、ICAM1和CD44与ST6GAL1的相互作用（图5C）。siRNA敲低发现下调PODXL、CD97、ECE1和ALCAM1能减少ST6KO肿瘤细胞的成簇，敲低PODXL的效果尤为显著（图5D-F）。
与单个CTC相比，CTC簇中PODXL的表达增加（图5G）。ST6KO细胞中PODXL蛋白水平升高但mRNA表达不变。去唾液酸化的PODXL蛋白（dP）与ST6KO细胞的结合强于其他组合（图5H）。这表明ST6GAL1介导的PODXL α2,6-唾液酸化可能负调控其稳定性和/或抑制肿瘤细胞簇形成所需的蛋白质结合活性。
图5 糖基化蛋白质组学分析揭示新的ST6GAL1 α2,6-SA化底物
尾静脉注射发现PODXL和ICAM1敲低可有效阻断肿瘤细胞转移定植和成簇（图6A-C），抗PODXL抗体能达成同样效果（图6D-I,N）。这表明PODXL作为ST6GAL1新靶点在PAX治疗中促进静止期CTC簇的形成和乳腺癌转移。
图6 靶向PODXL阻断ST6KO或化疗引起的转移
在乳腺癌中，由于ST6GAL1及其催化的α2,6-唾液酸化的缺失，CTC簇细胞处于静止期（G0），转移、定植及PAX化疗逃逸能力增加，导致患者不良预后。糖基化蛋白质组学分析揭示ST6GAL1糖基化底物PODXL有助于CTC成簇和转移定植。针对PODXL的中和抗体能缓解紫杉醇治疗耐药。
